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Hématopoïèse et son exploration
La moelle osseuse : organe de l’hématopoïèse
NOUVEAU:MISE À JOUR 2008 DISPONIBLE EN PDF I. DéfinitionsLa moelle osseuse est un tissu en suspension situé dans la cavité des os (figures 1 et 2), responsable de la production des cellules sanguines (hématopoïèse). La moelle osseuse constitue un tissu diffus dans l’organisme. Chez le petit enfant, tous les os contiennent une moelle osseuse à forte activité hématopoïétique. A partir de la puberté et chez l’adulte, seuls les os plats gardent une forte activité hématopoïétique, la moelle osseuse des os longs subissant une involution adipeuse Les os plats constituent ainsi des zones d’exploration possible de l’activité hématopoïétique, en réalisant une aspiration des cellules de la moelle osseuse qui, étalées sur une lame de verre, constitue le myélogramme (analyse cytologique des cellules de la moelle osseuse). Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) constituent initialement chez l’embryon les îlots de Woff et Pander qui apparaissent de façon concomitante à l’angiogénèse (21eme jour). A ce stade, leur différenciation est avant tout érythroblastique et les facteurs de stimulation des CSH dépendent des cellules endothéliales. Les CSH colonisent ensuite le foie et la rate qui assurent l’hématopoïèse durant la vie fœtale et y acquièrent la capacité de différenciation granulocytaire, monocytaire, mégacaryocytaire et lymphoïde. A l’approche de la naissance et dans les premiers mois de la vie, les CSH migrent dans la moelle osseuse. Cette migration explique la richesse particulière en CSH du sang fœtal et cordonal. La fonction de la moelle osseuse est d’assurer l’hématopoïèse. L’hématopoïèse constitue l’ensemble des phénomènes médullaires (prenant leur origine dans la moelle osseuse) assurant le maintien d’un pool de cellules souches hématopoïétiques, leur différenciation via leur engagement dans une lignée hématopoïétique et leur maturation, l’ensemble aboutissant à la production de cellules mobiles destinées à gagner les tissus de l’organisme afin d’en assurer leur homéostasie. Figure 1 : répartition anatomique de la moelle osseuse dans l’organisme de l’enfant et de l’adulte  Figure 2 : moelle hématopoïétique normale  II. Physiologie : les compartiments de la moelle osseuseLa moelle osseuse est un organe en suspension situé dans la cavité des os plats. Dans cette cavité, un fin réseau de fibres de réticuline et de cellules stromales soutiennent les cellules hématopoïétiques (stroma médullaire). Du point de vue phylogénique, les cellules hématopoïétiques se divisent en trois compartiments fonctionnels médullaires (figure 3). Figure 3 : Les compartiments de différenciation et de maturation de la moelle osseuse : les lignées myéloïdes et lymphoïdes  A. Le compartiment des cellules souches hématopoïétiquesIl existe dans la moelle osseuse des cellules mères dites cellules souches hématopoïétiques destinées à assurer le renouvellement à long terme de l’ensemble des cellules sanguines, myéloïdes et lymphoïdes. Ces cellules souches hématopoïétiques ont une propriété d’autorenouvellement et de différenciation.
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont identifiées comme cellules souches hématopoïétiques totipotentes ou pluripotentes. Elles sont capables :
(*) La plupart des CSH sont en phase G0 soit en repos mitotique prolongé (faible taux de renouvellement). La majorité de ces cellules sont hors-cycle et peu accessibles aux médicaments actifs sur le cycle cellulaire et utilisés en thérapie antitumorale. De plus, elles sont peu accessibles au transfert de gène (rendement de 1 à 3% seulement d’expression stable du gène transfecté). (**) Si la quantité des CSH reste stable tout au long de la vie, leur stabilité chromosomique s’altère avec le vieillissement physiologique via la perte de télomères, structures distales des chromosomes responsables de l’homéostasie génétique. Ceci explique l’augmentation de fréquence avec l’âge de certaines pathologies hématologiques malignes myéloïdes ou lymphoïdes car les CSH sont plus exposées à une instabilité génétique. L’exploration clinico-biologique de ce compartiment n’est pas aisée. On devine l’existence des CSH sur :
Figure 4 : hématopoïèse myéloïde et lymphoïde  (***) Dans la leucémie myéloïde chronique (LMC), l’événement transformant [la translocation chromosomique t(9 ;22)] survient dans le compartiment des CSH. De ce fait et en fonction de la dualité de différenciation lymphoïde et myéloïde des CSH, le chromosome anormal de lachromosomes 22, qui est plus « donneur » de matériel génétique que le chromosome 9 « receveur », présente un raccourcissement de son bras long : il est appelé chromosome Philadelphie) se retrouve dans l’ensemble des cellules myéloïdes, dans les lymphocytes B mais pas dans les lymphocytes T. Ceci tend à faire penser que l’origine de la lymphopoïèse T se situe plus en amont que celle de la lymphopoïèse B ou que l’événement transformant de la LMC survient en aval de la naissance des progéniteurs T. L’évolution hématologique d’une LMC peut générer une leucémie aiguë myéloïde (LAM) mais aussi (et plus rarement) une leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) de la lignée B (LAL-B). Les cellules souches hématopoïétiques peuvent, dans certaines circonstances d’activation, circuler de la moelle osseuse vers le sang et réciproquement. Cette propriété est utilisée en clinique humaine pour réaliser des greffes de cellules souches hématopoïétiques. On peut utiliser des précurseurs sanguins pour obtenir une reconstitution hématopoïétique à long-terme. B. Le compartiment des progéniteurs engagésLes progéniteurs engagés sont issus des CSH. Ils ont perdu leur capacité d’auto renouvellement et ils ont acquis une différenciation cellulaire : c’est le phénomène d’engagement. Après différenciation, les cellules souches hématopoïétiques aboutissent à des cellules encore incomplètement différenciées, mais qui ne sont plus capables d’autorenouvellement : ce sont les progéniteurs hématopoïétiques. Le processus aboutit finalement à des progéniteurs totalement prédéterminés se différenciant en une seule lignée (par exemple : le CFU-E précède immédiatement le proérythroblaste). On distingue :
Les cellules souches hématopoïétiques et les progéniteurs hématopoïétiques ne sont pas reconnus par le myélogramme. Il faut les mettre en évidence par d’autres techniques comme la reconstitution de l’hématopoïèse chez des souris irradiées et immunodéficientes, des systèmes de culture à long terme ou des systèmes de culture de progéniteurs hématopoïétiques : en raison de leur aptitude à former des colonies, on les appelle CFU pour « colony forming unit » (par exemple CFU-E ou CGU-GM pour respectivement les progéniteurs éryhroblastiques et granulo-monocytaires). C. Le compartiment des cellules maturesLe processus de différenciation et de maturation des cellules médullaires se déroulent sur plusieurs générations cellulaires et aboutit à la formation de cellules matures médullaires qui résident dans la moelle osseuse. Il s’agit des lignées érythroblastiques, mégacaryocytaires, granulo-monocytaires et lymphoïdes visibles et parfaitement identifiables sur un myélogramme standard. La fonction spécialisée d’une cellule mature n’est donc atteinte que progressivement après de nombreuses étapes intermédiaires (tableau I). Tableau I. Compartiments de différenciation cellulaire de la moelle osseuse et leur exploration  Les cellules médullaires les plus matures quittent la moelle osseuse par un phénomène de transmigration endothéliale (la barrière médullo-sanguine), rejoignent via la circulation sanguine les tissus dits périphériques de l’organisme soit les tissus non lymphoïdes (cellules myéloïdes) soit les tissus lymphoïdes (cellules lymphoïdes). La circulation lymphatique assure le drainage des informations antigéniques des tissus non lymphoïdes vers les organes lymphoïdes secondaires, organes d’excellence de l’élaboration de la réponse immunitaire (tableau II). Tableau II. Les cellules matures hématopoïétiques : origine et destinée  D. Le stroma médullaireL’implantation des cellules hématopoïétiques au sein du stroma médullaire dépend de l’expression de protéines d’adhésion à leur surface et de leurs récepteurs sur les cellules stromales : il s’agit de sélectines, de sialomucines et d’intégrines (****). De même, la traversée endothéliale et la migration sanguine des cellules hématopoïétiques matures dépendent de la régulation négative de l’expression membranaire d’intégrines (*****). (****) L’expression des molécules d’adhésion spécifiques du stroma de la moelle osseuse explique que lors d’une greffe de moelle osseuse, les CSH sont injectées dans le sang et rejoignent spontanément les cavités médullaires par un phénomène de transmigration endothéliale reverse : c’est le phénomène de « homing ». (*****) En pathologie, la translocation t(9 ;22) de la leucémie myéloïde chronique génère la production d’une protéine hybride issue de la fusion des gènes dits abl (du chromosome 9) et bcr (du chromosome 22), la protéine bcr-abl. La protéine bcr-abl inhibe l’expression d’intégrines et explique la migration massive de cellules myéloïdes dans le sang (phénomène de myélémie). Le stroma médullaire constitue un tissu de soutien et de nutrition de l’ensemble cellules hématopoïétiques. Il est composé de cellules (cellules de la matrice cellulaire de l’os, cellules musculaires lisses, adipocytes, cellules endothéliales, fibroblastes) et d’un réseau de fibres de réticuline (*** ***). Des cellules souches mésenchymateuses sont également présentes dans la moelle osseuse et elles sont à l’origine des cellules du stroma de la moelle osseuse, des ostéoblastes, des cellules adipeuses et des cellules musculaires lisses. (*** ***) En pathologie, ce réseau de fibres peut se modifier et générer des phénomènes de densification du réseau appelé myélofibrose réticulinique, collagène voire d’ostéomyélosclérose. Ces phénomènes perturbent la régulation de la migration sanguine des cellules hématopoïétiques et génèrent une myélémie et/ou une érythroblastémie. Les communications intercellulaires entre les cellules hématopoïétiques et les cellules stromales se font :
a. Les facteurs de croissance hématopoïétique La différenciation hématopoïétique implique des phénomènes cellulaires intrinsèques dits stochastiques (et aléatoires) et des facteurs extrinsèques dits facteurs de croissance. Il s’agit de glycoprotéines agissant comme des hormones endocrines ou paracrines sur les CSH et les progéniteurs via l’expression par ces cellules de récepteurs membranaires. On peut les séparer en deux familles : 1. Les facteurs de différenciation terminale qui sont l’érythropoïétine pour la lignée érythroblastique, la thrombopoïétine pour la lignée magécaryocytaire, le G-CSF pour la lignée granuleuse, le M-CSF pour la lignée monocytaire, Le GM-CSF pour les progéniteurs granulomonocytaires, l’interleukine 5 pour la lignée éosinophile. 2. Les facteurs de croissance actifs en amont sur le compartiment de cellules souches totipotentes. Ils régulent la vie des CSH. Le « stem cell factor » (SCF) intervient précocément dans la différenciation hémaopoïétique. De nombreuses interleukines comme l’IL-3 ou l’IL-6 et des chemokines comme SDF1 jouent un rôle dans la différenciation et la mobilité des CSH (tableau III). Tableau III. Les facteurs de croissance hématopoïétique (*)
(*) Ont été seulement retenus dans ce tableau les facteurs de croissance hématopoïétiques actuellement utilisés en clinique humaine. L’expression sur les précurseurs médullaires de récepteurs aux facteurs de croissance est déterminante dans la programmation de la différenciation cellulaire. Au cours de la différenciation cellulaire, l’expression des récepteurs d’abord exprimés en faible abondance se restreint secondairement à l’expression d’un récepteur donné qui devient fortement exprimé à la membrane et favorise la diffréenciation vers une lignée hématopoïétique donnée. L’expression de ces récepteurs dépend elle-même d’une régulation génétique via des facteurs nucléaires de transcription plus ou moins spécifiques d’un stade et d’un type de différenciation : ces facteurs de transcription sont exprimés dans les cellules souches et les progéniteurs. Leur rôle fondamental dans la différenciation hématopoïétique peut être mis en évidence par l’inactivation expérimentale de gènes : l’inactivation du gène GATA1 inhibe la différenciation érythroïde, celle de PU1 la différenciation granulo-monocytaire, celle du facteur TAL/SLC l’ensemble de la myélopoïèse. b. Les inhibiteurs de l’hématopoïèse A côté des facteurs de croissance hématopoïétiques, il existe des cytokines et chémokines (facteurs chémo-attractants) qui possèdent la propriété d’inhiber l’hématopoïèse, par leur capacité à inhiber la prolifération des CSH et des progéniteurs. Il s’agit par exemple du « transforming growth factor-alpha » (TGF-alpha), du « tumor necrosis factor-alpha » (TNF-alpha), du « macrophage inflammatory protein alpha » (MIF-1 alpha). Par ailleurs, des peptides sont également connus comme inhibiteurs de l’hématopoïèse tel le peptide 1-4 issu du clivage d’un neuropeptide appelé substance P (peptide de 11 aa), le tétrapeptide AcSDKP, le pentapeptide pEEDCK. Au total, une hématopoïèse à long-terme est possible grâce à l’existence de cellules souches hématopoïétiques assurant la production prolongée des cellules sanguines. Elles possèdent en effet une capacité fondamentale ; celle de l’autorenouvellement. Leur différenciation vers les cellules matures implique de nombreuses générations cellulaires progressivement déterminées vers une lignée hématopoïétique grâce à l’expression de récepteurs aux facteurs de croissance. III. Fonction de la moelle osseuse : l’hématopoïèseLa fonction de la moelle osseuse est d’assurer l’hématopoïèse, c’est-à-dire l’ensemble des phénomènes médullaires qui aboutissent à la production de l’ensemble des cellules sanguines du sang circulant. L’hématopoïèse comprend :
A. La myélopoïèsea. Définition La myélopoïèse constitue l’ensemble des phénomènes cellulaires assurant la différenciation et la maturation des progéniteurs myéloïdes indifférenciés puis engagés dans la différenciation vers l’une des lignées myéloïdes facilement identifiables, c’est-à-dire les lignées érythroblastique, granulo-monocytaire et mégacaryocytaire. Cette différenciation est associée à la synthèse de protéines cytoplasmiques impliquées dans la fonction de la cellule mature (ex : synthèse de l’hémoglobine pour la lignée érythroblastique) et à l’expression de protéines de membrane spécifiques de lignée (*). L’ensemble de ces phénomènes aboutit en la production de cellules myéloïdes matures, c’est-à-dire de façon prédominante la production des globules rouges (érythropoïèse), des polynucléaires (granulopoïèse), des monocytes (monocytopoïèse) et des plaquettes (thrombocytopoïèse). (*) L’expression de ces protéines de membrane et spécifiques de lignée est analysée sur la surface des blastes de leucémies aiguës dans le but de réaliser le diagnostic d’appartenance de lignée (lignée myéloïde ou lymphoïde), en particulier si l’analyse cytologique n’arrive pas à classer la cellule blastique. Leur expression est analysée à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques : c’est la raison pour laquelle ces protéines sont désignées « antigènes » de membrane et par extension cluster de différenciation (CD). b. Exploration clinique Le phénomène de différenciation myéloïde est identifiable in vitro par :
1. Le myélogramme Les cellules myéloïdes matures sont identifiables sur une analyse cytologique d’un frottis médullaire : c’est le myélogramme. Il est possible par cet examen morphologique d’identifier les cellules appartenant à la lignée érythroblastique, à la lignée granuleuse et monocyto-macrophagique et à la lignée mégacaryocytaire. De plus, l’analyse du myélogramme a pour but de déterminer la proportion relative d’une cellule ou d’une lignée par rapport à l’ensemble des cellules nucléées médullaires. 2. Techniques de culture des progéniteurs engagés : l’identification de colonies in vitro (**) Un progéniteur myéloïde peut donner en culture une descendance de cellules filles myéloïdes toutes identiques : c’est une colonie hématopoïétique. L’apparition de cette descendance est liée à l’induction d’une différenciation cellulaire sous l’effet d’une stimulation appropriée du progéniteur par une cytokine. L’érythropoïétine induit l’apparition de colonies hémoglobinisées dites érythroïdes à partir d’un progéniteur érythroblastique : le BFU-E et le CFU-E pour « burst-forming unit-erythroid et colony-forming unit-erythroid » selon l’aspect des colonies. Une autre cytokine, le GM-CSF (« granulocyte-macrophage colony-stimulating factor » induit la différenciation des CFU-GM (« granulocyte macrophage colony-forming unit ») en colonies de cellules granuleuses et macrophagiques. De même, il est possible d’identifier des progéniteurs mégacaryocytaires dits CFU-MK (« megacaryocyte colony-forming unit »). (**) L’exploration in vitro des progéniteurs myéloïdes est réalisée en pratique hématologique courante par les méthodes de culture des progéniteurs afin de les quantifier dans un prélèvement de moelle osseuse (insuffisance médullaire ou quantification d’un greffon médullaire) ou de qualifier leur comportement in vitro (dans les syndromes myéloprolifératifs telles la polyglobulie de Vaquez et la thrombocytémie essentielle, une pousse autonome et spontanée de progéniteurs BFU-E et/ou CFU-MK est observée). c. L’érythropoïèse Le caractère de différenciation de la lignée érythroblastique est la synthèse de l’hémoglobine. La basophilie importante du cytoplasme des stades précoces (proérythroblastes et érythroblastes basophiles) est liée à la richesse en acide ribonucléique. La synthèse de l’hémoglobine donne une coloration polychromatophilique puis acidophilique au cytoplasme des érythroblastes polychromatophiles puis acidophiles (la molécule d’hémoglobine est acidophile par son pH alcalin). Le réticulocyte est une cellule anucléée, ne contenant que des résidus chromatiniens et contenant une concentration d’hémoglobine de 32 à 36% du contenu de l’hématie. Dès que la synthèse de l’hémoglobine entraîne une concentration précise de la protéine dans le cytoplasme, l’inactivation de la chromatine se réalise et le noyau perd la capacité de se diviser. d. La granulopoïèse Le caractère essentiel de différenciation de la lignée granuleuse est représenté par l’élaboration des protéines des granules cytoplasmiques. Les granulations précoces sont azurophiles (stade de myéloblaste), contiennent des enzymes de la bactéricidie (myéloperoxydase, lysozyme, phosphatases..). Des granulations spécifiques de lignée apparaissent ensuite au stade de promyélocyte. 1. Les polynucléaires neutrophiles (PNN) contiennent des granulations peroxydases primaires peroxydases positives riches en myéloperoxydase, en lysozyme, en protéases neutres telles l’élastase ou la collagénase, des hydrolases à pH acide telles des glycosidases et phosphatases acides, des granulations secondaires spécifiques riches en lactoferrine, lysozyme et collagénase et des granulations tertiaires contenant des mucopolysaccharides acides. Ils assurent un rôle de phagocytose et de cytotoxicité vis-à-vis d’agents bactériens et fongiques et présentent une pathogénicité dans les réponses de cytotoxicité vis-à-vis de certains tissus après leur activation par le complément ou les leucotriènes. 2. Les polynucléaires éosinophiles (PNE) contiennent des granulations riches en pexoxydase (différente de la myélopexoxydase du PNN), en protéine basique spécifique (elle représente 55% des protéines du granule) et en phospholipase D. Ils assurent un rôle dans la destruction des formes larvaires des helminthes et présentent une pathogénicité tissulaire dans les réponses allergiques. 3. Les polynucléaires basophiles (PNB) sont riches en histamine, en mucopolysaccharides acides, en « platelet activating factor » (PAF). Ils dégranulent en présence de complexes IgE-allergène. C’est par l’intermédiaire de la dégranulation que les PNB interviennent dans les phénomènes immunitaires tels le choc anaphylacytique (libération d’histamine) et l’allergie atopique. e. La thrombocytopoïèse La différenciation mégacaryocytaire est associée à la synthèse de glycoprotéines plaquettaires (Ib, IIbIIIa...) et de la synthèse du récepteur au facteur Willebrand. Il existe un phénomène d’endoploïdie et de synthèse de membranes de démarcation délimitant les futures plaquettes. L’augmentation du volume plaquettaire est un signe de maturation cytoplasmique mégacaryocytaire inachevée. B. La lymphopoïèseLa lymphopoïèse est l’ensemble des phénomènes cellulaires qui aboutissent à la production de cellules lymphoïdes fonctionnelles par différenciation de précurseurs hématopoïétiques lymphoïdes (figure 5). La différenciation lymphoïde est indépendante de l’antigène. La maturation des cellules lymphoïdes en cellules effectrices de la réponse immunitaire, étape appelée immunopoïèse, est quant à elle dépendante de l’antigène. a. La lymphopoïèse B 1. Localisation Elle est caractérisée par sa localisation anatomique exclusivement médullaire chez l’adulte. Elle est indépendante de l’antigène : en effet la moelle osseuse n’est pas un site privilégié de présentation de l’antigène (il s’agit du ganglion lymphatique). Elle est génératrice de lymphocytes B vierges et naïfs. Il s’agit d’un processus dégénéré car 1010 lymphocytes B sont produits chaque jour mais parmi ces cellules, beaucoup d’entre elles meurent par apoptose en l’absence de réarrangement productif des gènes des immunoglobulines. Contrairement à la lymphopoïèse T de localisation thymique qui régresse à la puberté, la différenciation B se poursuit tout au long de la vie. L’étape de différenciation B est contrôlée par les cellules du micro environnement médullaire (cellules stromales, cellules endothéliales, lymphocytes T) et les molécules du stroma comme des cytokines telles les interleukines 7, 1, 3 et 4. C’est au sein de cet environnement que se succèdent les étapes de différenciation des lymphocytes B à partir d’une cellule souche lymphoïde. Figure 5. La lymphopoïèse B et T  2. Physiologie Les premiers précurseurs médullaires B identifiables sont :
b. La lymphopoïèse T 1. Localisation Le thymus représente le site essentiel à la différenciation lymphocytaire T. Les CSH donnent naissance aux précurseurs des thymocytes T qui migrent rapidement dans le thymus. Les futurs lymphocytes T, issus des cellules souches hématopoïétiques médullaires, trouvent dans le thymus l’environnement favorable à leur différenciation. Les précurseurs Td’origine médullairesedifférencient dans le thymus sous l’influence de facteurs cellulaires et humoraux. 2.Physiologie La lymphopoïèse T est thymique. La production des lymphocytes T par le thymus augmente depuis la 10eme semaine de vie fœtale jusqu’à la puberté oùelle régresse de façon importante. Dans le thymus, la différenciation lymphocytaire T comprend 3 stades :
IV. Exploration de l’hématopoïèse en pratique cliniqueEn pratique clinique hématologique, l’exploration de l’hématopoïèse repose sur : 1. L’examen clinique L’examen clinique est d’importance capitale pour repérer les symptômes cliniques évocateurs d’une insuffisance de l’hématopoïèse (insuffisance médullaire) : il s’agit d’un syndrome anémique, d’un syndrome hémorragique d’origine plaquettaire, d’un syndrome infectieux d’origine granulocytaire, syndromes isolés ou associés. La symptomatologie liée à ces syndromes sera analysée dans les chapitres correspondants de l’anémie, de la thrombopénie et de la neutropénie. 2. L’hémogramme L’hémogramme correspond à l’analyse des cellules sanguines. Il est de réalisation simple et sa normalité témoignent d’une hématopoïèse physiologique. La numération des réticulocytes est également un examen simple et utile pour l’exploration de l’érythropoïèse, leur nombre étant proportionnel à la production érythropoïétique. 3. Examens médullaires Les examens médullaires explorent la fonction hématopoïétique et sont du domaine de l’hématologiste. Il s’agit du myélogramme et de la biopsie ostéomédullaire.
Le frottis sanguin :  Il correspond à la confection d’un étalement de sang sur lame de verre, puis à sa coloration. Les cellules sanguines ainsi fixées et colorées (méthode de May-Grünwald Giemsa) sont observées au microscope. Cette analyse morphologique est une étape importante dans l’interprétation d’un hémogramme. Ainsi on distingue classiquement 3 catégories cellulaires : Erythrocytes :
Leucocytes :
Plaquettes :
4. Selon la pathologie médullaire explorée, d’autres examens peuvent être réalisés par l’hématologiste :
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