L’observation d’un contrôle génétique chez la souris de la prise ou du rejet de tumeurs greffées a conduit à la découverte du CMH. Le système HLA, CMH de l’homme, est un ensemble de gènes situes sur le bras court du chromosome 6, qui s’expriment principalement a la surface des cellules immunocompétentes sous la forme de glycoprotéines transmembranaires. Les réactions allogéniques humorales et cellulaires survenant après transfusion et transplantation ont permis de découvrir la fonction physiologique principale de ces antigènes : le contrôle des réponses immunitaires contre les agents étrangers. Outre leur rôle essentiel en transplantation, leur intérêt médical est considérable car certains allèles du CMH confèrent une susceptibilité ou une résistance génétique à de nombreuses pathologies, notamment auto-immunes.

Le système HLA est le complexe génétique fonctionnel de l’homme le plus polymorphe, avec de nombreux loci exprimant pour la plupart de nombreux allèles (jusqu’à 80). Cette diversité déjà importante chez chaque individu est considérable au niveau de la population générale. Mis en évidence dès 1958 par des réactions sérologiques d’agglutination des globules blancs, puis par un test de micro lymphocytotoxicité, le polymorphisme du système a été disséqué dans un premier temps grâce aux approches classiques de la génétique, c’est-à-dire des études de ségrégation familiale et de répartition dans la population.

Deux classes principales d’antigènes ont été décrites : les antigènes de classe I (HLA-A, B et C) présents sur la quasi-totalité des cellules de l’organisme et les antigènes HLA de classe II (HLA-DR, DQ et DP) restreints aux lymphocytes B, aux monocytes et macrophages. L’expression aberrante d’antigènes de classe II sur des cellules qui ne les expriment pas à l’état physiologique est un des stigmates des états auto-immune des rejets et des réactions du greffon contre l’hôte. Les molécules du système HLA de classe I et de classe II ont pour fonction principale de présenter les antigènes aux cellules T. Cette présentation est génétiquement restreinte par le système HLA, et l’ensemble antigène peptide d’origine endogène ou exogène molécule HLA (zone polymorphe) est reconnu par un récepteur spécifique de la cellule T. Il s’ensuit une activation T spécifique. Les molécules HLA de classe I présentent un antigène peptidique originaire du cytosol de la cellule (protéine du soi ou protéine virale), avant d’être transféré dans le réticulum endoplasmique. Les molécules HLA de classe II présentent des antigènes d’origine exogène localisés dans les compartiments lyso-endosomiaux après leur endocytose. Les molécules accessoires (CD8 pour HLA classe I, CD4 pour HLA classe II) orientent la réponse immunitaire vers la cytotoxicité (cellules CTL CD8) ou la prolifération (cellules helper CD4), mais les mécanismes de reconnaissance et de restriction génétique sont identiques. La dichotomie classe I versus classe II a pu être expliquée récemment, non par des différences structurales intrinsèques des molécules HLA, mais par les voies intracellulaires tutelles empruntent (exocytose pour les molécules de classe I, endocytose pour les molécules de classe II) et les partenaires antigéniques (peptides du soi et d’origine virale pour la première, peptides bactériens et provenant de toxines pour la seconde) tutelles rencontrent, chargent, transportent et vont présenter aux cellules T capables de reconnaître leurs combinaisons spécifiques .

Les réactions allogéniques au cours des greffes sont considérées comme des réponses antigéniques classiques ou l’allo-antigéne devient lui-même un antigène (seul ou associé à des peptides du soi) qui, reconnu comme étranger sera responsable d’un rejet (CTL) ou d’une prolifération (GVH). Au cours des rejets, les lymphocytes T cytotoxiques CD8 ami-classe I sont les effecteurs principaux, même si des réponses cytotoxiques ami-classe II (CTL CD4) sont décelées. Dans la GVH, les réponses prolifératives CD4 anticlasse II prédominent.

Les progrès de la biochimie et de la biologie moléculaire permettent une vision précise tridimensionnelle du polymorphisme HLA et des interactions entre molécules HLA, peptides antigéniques et récepteurs T. L’obtention en 1987 de cristaux de molécules HLA de classe I de haute résolution, et plus récemment de cristaux de molécules HLA de classe II, permet de localiser très précisément les régions, les acides amines et leurs chaînes latérales responsables des caractéristiques sérologiques et fonctionnelles des molécules HLA.

Organisation génétique : la région HLA

  Définition de la région HLA

Région génétique qui s’oppose aux transplantations de tissus entre des individus de la même espèce, la région HLA (région H2 chez la souris) a été initialement caractérisée par des méthodes d’immunogénétique classique, sérologiques et cellulaires. Deux grands ensembles ont été définis : les antigènes HLA de classe I (HLA-A, B et C), responsables du rejet des allogreffes, et les antigènes HLA de classe II, responsables des réactions lymphocytaires mixtes (MLR) et du contrôle des réponses immunitaires a certains antigènes. Les recombinants naturels familiaux (chez l’homme) et les animaux recombinants (lignées congéniques) ont permis d’établir les limites respectives de ces ensembles et leur organisation génétique, très différente chez la souris, ou la région I (classe II) est insérée entre les principaux gènes de classe I (K et D, L), et chez l’homme, ou la région HLA-D (classe II) est centromérique par rapport a la région des gènes de classe I. Les approches biochimiques ont ensuite révélé les caractéristiques structurales des molécules HLA de classe I et II, produits des gènes respectifs qui ont ensuite été clones, localisés et séquencés. Le séquençage de nombreux allèles des mêmes gènes a permis d’établir les bases structurales du polymorphisme.

  Polymorphisme HLA

Une des caractéristiques du système HLA est le nombre d’allèles que de nombreux loci peuvent exprimer. Ce polymorphisme est illustré depuis le premier antigène Mac décrit en 1958 par J. Dausset jusqu’à la nomenclature la plus récente (nomenclature HLA 1992). Son recensement est encore incomplet. Mis en évidence grâce à des données sérologiques et cellulaires, le polymorphisme est désormais établi par l’étude de la variabilité de la séquence en acides amines (AA) (déduite de la séquence nucléotidique) des domaines des molécules HLA qui permet de caractériser les nouveaux allèles et les régions les plus polymorphes des molécules HLA de classe I et II. Certains allèles d’un locus sont associés préférentiellement avec des allèles spécifiques d’un autre locus : liaisons entre les allèles de classe I et II (Al B8), entre des allèles de la région de classe II (DQA et DQB) ou entre classe I et classe II (B8-DR3). Ce phénomène appelé déséquilibre de liaison reste inexpliqué et varie ainsi que la fréquence des différents allèles selon et dans les différentes ethnies.

  Carte physique

Le clonage de la région HLA dans des cosmides contigus et chevauchants de 30 a 50 Kb chacun et l’analyse de leur contenu ont été récemment complétés par l’obtention de l’intégralité de la région HLA sous forme d’une banque de YAC (Yeast artificial chromosome), dont la séquence complète ne saurait tarder. La carte physique actuelle de la région HLA est représentée sur la figure 810-I. Sur le bras court du chromosome 6 (région 6 p 21.3) sont situées :

• la région de classe I, d’environ 2000 Kb, télomérique codant pour les chaînes lourdes des molécules HLA de classe I (A-B-C) ainsi que pour d’autres gènes (E. F, G et H) HLA classe I récemment découverts ;
• la région de classe II, d’environ 1000 Kb, centromérique codant pour les chaînes A et B des molécules HLA de classe II et pour les nouveaux gènes TAP (TAPI-TAP2) et LMP (LMP2 et LMP7) impliqués dans la maturation et le trafic intracellulaire des molécules HLA de classe I ;
• ces deux régions sont séparées par la région de classe III (SW à 1000 Kb), codant pour des composants du complément (C4 B7 C2) et de la 21 hydroxylase (21 OH). De nombreux autres gènes, dont ceux du TNF et de la protéine de choc thermique Hsp 70, sont situés entre les régions de classe III et I. Les gènes HLA sont composés de séquences codantes (exons) séparées par des régions non codantes (introns). L’organisation génomique en exons reflète celle de la structure protéique en domaines.

Figure 810-1 Carte des gènes du complexe majeur d’histocompatibilité de l’homme.
(D’après RD Campbell et J Trowsdale. Map of the human major histocompatibility complex, Immunol Today, 1993, 14 : 350-351, centerfold.) :

Gènes et molécules HLA de classe I

HLA : A, B, C

La structure des AG HLA de classes I et II est représentée dans la figure 810-2. Ces antigènes transmembranaires sont composes : d’une chaîne glycoprotéique de 45 kilodaltons (kDa) divisée en trois domaines extracellulaires correspondant aux 3 exons des gènes de classe I, d’une région transmembranaire et une région intracytoplasmique codées par 2 ou 3 exons et portant un site de phosphorylation. Le polymorphisme est limité à une ou plusieurs zones d’hypervariabilité dont la principale réside au niveau du domaine le plus externe. Cette chaîne lourde glycosylée s’associe de manière non covalente avec la ß2-microglobuline qui, elle, est monomorphe et codée par le chromosome 15. Le niveau d’expression de la ß2- microglobuline contrôle en partie celui de la chaîne lourde à la surface cellulaire, expliquant son accumulation intracytoplasmique dans les cellules qui ont un défaut de synthèse de la ß2-microglobuline. L’association entre chaîne lourde et microglobuline ß2m a lieu très précocement dans le réticulum endoplasmique. La structure tridimensionnelle de la partie extracytoplasmique des molécules de classe I est connue en détail. L’unité fonctionnelle composée des domaines a1 et a2 organisés symétriquement forme une cavité, dont le fond est fermé par l’alignement antiparallèle des feuillets plissés ß et les bords par deux structures a hélicoïdales. Le séquençage des gènes de classe I associé au modèle 3 D permet de localiser chaque AA (ou ensemble d’AA polymorphes) au niveau des hélices a et des feuillets ß et d’établir les bases structurales précises du polymorphisme. La nomenclature HLA 1992 dénombre 41 allèles A, 61 allèles B et 18 allèles C. La variabilité est concentrée au niveau des exons codant pour les domaines a1 a2 constitutifs du site de liaison du peptide et de la région de contact avec le TCR (CD3). Cette région délimite une cavité destinée à accueillir le (ou les) peptide(s) antigénique(s) d’origine cytosolique et chargés dans cette cavité au niveau du réticulum endoplasmique. De la même manière, la ß2- microglobuline et le(s) peptide(s) participent au transport de la molécule HLA de classe I et à son expression à la surface cellulaire. Le passage transmembranaire des peptides cytosoliques vers le réticulum endoplasmique est assure en partie ou en totalité par des pompes dont les gènes dénommés TAP1 et TAP2 sont codés par la région HLA de classe II. Ils forment un canal transmembranaire qui permet un transfert plus ou moins sélectif des peptides cytosoliques (peptides du soi) aux molécules HLA de classe I.

  HLA : E, F, G, H

Des études au niveau génomique ont permis de détecter de nouveaux gènes classe I appelés HLA-E, F. G, H et J (ou X). Le gène HLA-E est localisé entre HLA-A et HLA-C. Des transcrits de ce gène sont trouvés dans une grande variété de tissus et leur niveau d’expression, comme pour les gènes HLA classe I classiques, peut être augmenté par traitement par l’interféron gamma. Mais l’expression stable d’une molécule HLA-E à la surface des cellules n’a pas été clairement prouvée. Le gène HLA-E est le plus divergent au sein des gènes HLA classe I. Son polymorphisme est restreint, avec seulement 4 allèles décrits. Le gène HLA-F est le plus télomerique des gènes HLA actuellement connus. La distribution tissulaire des transcrits semble reduite aux cellules T au repos et activées ainsi qu’aux cellules EBV. Mais l’expression membranaire de la molécule est peu probable. Le gène HLA-G, situé entre les gènes HLA-F et HLA-A, est non polymorphique et codé pour la chaîne a de la molécule HLA-G exprimée à la surface des cellules cytotrophoblastiques au cours du premier trimestre de la grossesse. Cela suggère que les molécules HLA-G pourraient jouer un rôle protecteur contre les rejets et infections du placenta. Les gènes HLA-H et J (ou X) sont des pseudogènes situés à proximité de HLA-A.

Figure 810-2 Structure des AG HLA de classe I (a) et de classe II (b). (D’ après A Carpentier et D Farge, Transplantation d’organes, 1992, Paris, Médecine-Sciences Flammarion.) :

Gènes et molécules HLA de classe II

Les antigènes HLA de classe II sont des structures hétérodimériques comportant une chaîne a et une chaîne ß associées de manière non covalente (voir figure 810-2). Toutes deux sont des glycoprotéines transmembranaires de34 kDa et 28 kDa respectivement, qui s’associent pour former 3 isotypes principaux DRa-DRb, DQa-DQb, DPa-DPb.

La sous région DR comporte un gène A monomorphe codant pour la chaîne a des molécules HLA-DR et un ou plusieurs loci B en fonction des haplotypes. Ce polymorphisme haplotypique se manifeste par une organisation différente et un nombre variable de gènes DRB sur un chromosome. Cinq groupes haplotypiques ont été identifiés. En plus de ce polymorphisme haplotypique, il existe un important polymorphisme allélique. L’ensemble des allèles actuellement connus est fixé par la nomenclature HLA (tableau 810-1) avec 62 allèles HLA-DRBI, 4 allèles DRB3, 1 allèle DRB4, 4 allèles DRBS, 14 allèles DQAI, 19 allèles DQBI, 8 allèles DPAI et 37 allèles DPBI. Comme pour les gènes HLA classe I, le polymorphisme est concentré dans trois régions hypervariables qui sont pour les gènes DR les nucléotides codant pour les AA en position 9-13, 26-33 et 67-74. Caractéristique déjà signalée du système HLA, le déséquilibre de liaison est marqué entre les allèles DRB, DQA et DQB. En revanche, il existe très peu de déséquilibre de liaison entre les gènes DR, DQ et DP. Les déséquilibres de liaison ont été bien étudiés dans la population caucasoïde et certaines associations alléliques sont spécifiques d’une population. L’existence d’un déséquilibre de liaison entraîne une réduction du polymorphisme HLA et augmente dans une population donnée les chances de trouver des donneurs de moelle ou d’organes compatibles avec un receveur non apparenté. Il existe un polymorphisme supplémentaire issu de l’association des chaires a et p des 2 haplotypes par transcomplémentation, à l’intérieur d’un isotype (DQ, voire DP). Ces molécules hybrides, décrites chez des sujets hétérozygotes, sont génératrices d’un polymorphisme fonctionnel et sont le support moléculaire de nombreuses associations HLA et maladies.

Techniques d’étude des antigènes HLA

  Typage sérologique

La sérologie a été la base de la définition du système HLA et est encore utilisée dans la plupart des laboratoires. La sérologie classique peut révéler de nouvelles spécificités qui seront affirmées par les techniques de séquençage et aider à identifier des epitopes fonctionnels. Les anticorps monoclonaux contribuent a la sérologie et certains sont déjà utilisés en routine. Des cellules transvectées et des animaux transgéniques sont utilisables pour rechercher et mieux caractériser des sérums, les anticorps obtenus par ces approches révélant de nouvelles spécificités.

Les techniques sérologiques, appliquées à l’étude du CMH, reposent sur l’aptitude des anticorps à reconnaître des déterminants allotypiques de ces molécules, à la surface cellulaire. La technique la plus utilisée est la microlymphocytotoxicité dépendante du complément (Terasaki et McClelland, 1964). Le principe est le suivant : lorsqu’un anticorps reconnait un déterminant antigénique à la membrane d’une cellule, dénommée cible, la séquence du complément est activée au site de la réaction antigène/anticorps et aboutit a la lyse de la cible.

La principale source d’anticorps anti-HLA provient de l’immunisation facto-maternelle, moins souvent de l’immunisation après transfusion ou transplantation. Les ACMC (anticorps monoclonaux) sont de plus en plus utilises car spécifiques des produits du CMH. Cette analyse sérologique fine n’est possible que si le laboratoire possède un panel de référence, étudié avec des anticorps définis au cours des ateliers internationaux afin de contrôler les réactifs locaux par rapport a ceux définis internationalement.

Les techniques usuelles sont utilisées pour détecter les allèles de classe II. Les antigènes de classe II n’étant pas ubiquitaires, la microlymphocytotoxicité est réalisée sur lymphocytes B préalablement isolés.

Le cross match permet de rechercher par un test de lymphocytotoxicité ou par cytométrie de flux la présence chez le receveur d’anticorps (notamment de type IgG) spécifiques du donneur et susceptibles d’entraîner un rejet suraigu. La spécificité anti-HLA classe I (testée sur cellules B et T) de ces anticorps est une contre-indication à la greffe, alors qu’une spécificité anticlasse II (testée sur lymphocytes B uniquement) serait moins délétère.

  Typage moléculaire

Les avantages décisifs des techniques de biologie moléculaire (étude directe des gènes polymorphes avec une précision absolue, absence de limite à l’obtention de réactifs) ne sont encore applicables en routine qu’aux allèles HLA de classe II et le seront bientôt aux allèles HLA de classe I

Les techniques faisant appel à la biologie moléculaire reposent sur la connaissance du polymorphisme des séquences nucléotidiques de l’ADN des gènes HLA. L’amplification spécifique d’un fragment d’ ADN génomique est obtenue par réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Les allèles sont détectés à l’aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques (dot blot ou reverse dot blot) PCR-SSO ou d’enzymes de restriction PCR- RFLP pour HLA-DRB. La finesse du typage (typage générique 18 allèles versus typage spécifique 45 allèles) dépend de l’indication même de celui-ci. Plus de 100 allèles sont définis au niveau des loci HLA classe II, mais certains d’entre eux sont moins fréquents chez les Caucasiens.

L’établissement d’une stratégie de typage de routine dépend de son but. Typage de donneurs volontaires de moelle en vue de constituer un fichier national (typage générique automatisé) ; recherche d’identité entre donneur et receveur en cas de greffe de moelle osseuse (typage complet) ou d’organes (typage générique) ; recherche d’une prédisposition génétique dans le cadre d’associations HLA et maladies (typage cible) ; études anthropologiques ; médecine légale.

Aspects cliniques

  Greffes de rein

L’importance de la compatibilité HLA dans le devenir des allogreffes rénales est bien établie. La survie à 10 ans est d’environ 75 p. 100 chez les germains (frères et soeurs) HLA identiques et de plus de 50 p. 100 si un seul haplotype est partagé, comparée à une survie a 10 ans de 40 p.100 pour les reins de cadavres. L’introduction de la ciclosporine a amélioré ces résultats, qui restent néanmoins meilleurs selon le degré de compatibilité. Les séries alléliques A B ainsi que DR DQ sont impliquées dans ce phénomène.

Si la précision obtenue par le typage moléculaire va permettre une appréciation plus juste du rôle respectif des loci et allèles du CMH, la survenue d’épisodes de rejet chez les germains HLA identiques reflète l’existence d’antigènes mineurs d’histocompatibilité. L’établissement futur d’une hiérarchie des incompatibilités devrait permettre de sélectionner les moins immunogènes sur le plan fonctionnel.

  Autres transplantations d’organes

Le rôle bénéfique de la compatibilité HLA est démontré pour les transplantations de coeur de pancréas et de cornée, même si cette compatibilité n’entre pas encore dans les critères de sélection pour des raisons logistiques. Le rôle de la compatibilité HLA reste controversé en transplantation hépatique.

  Greffe de moelle

La moelle osseuse contient des cellules souches immunologiquement compétentes, myéloïdes et lymphoïdes, qui expliquent la survenue, a côté de la réaction de rejet décrite pour toute greffe d’organe, de réaction du greffon contre l’hôte (GVH). La GVH, due à l’activation des cellules T contenues dans la moelle du donneur et dirigées contre les antigènes majeurs ou mineurs d’histocompatibilité du receveur, comprend plusieurs étapes : reconnaissance des antigènes d’histocompatibilité du receveur par les cellules T du donneur, activation des cellules T du donneur et des cellules cibles du receveur, cytotoxicité cellulaire par l’intermédiaire des lymphokines sécrétées par les cellules B et T activées. La conséquence finale de la GVH est la destruction des tissus cibles (kératinocytes, cellules glandulaires de l’intestin, cellules des canalicules biliaires du foie) avec un déficit immunitaire profond, responsable d’infections parfois létales. Le risque de rejet augmente en cas de disparité HLA entre donneur et receveur. Un cross match sérologique positif contre les cellules T ou B du donneur semble corrèle avec le rejet dans les greffes HLA incompatibles.

La GVH, létale dans 20 p. 100 des cas, explique les critères de choix du donneur.

• Le premier choix se portera sur une greffe syngénique à partir d’un jumeau monozygote. L’homozygotie peut être affirmée par les méthodes sérologiques classiques, les techniques de culture mixte lymphocytaire et de typage par biologie moléculaire. Le finger printing et le DNA cross match utilisant la technique des hétéroduplexes de l’ADN, l’étude des mini satellites d’ADN permettent d’affirmer l’identité totale entre deux individus et semblent les méthodes de choix pour affirmer la monozygotie. La greffe syngénique apparait idéale puisqu’elle ne s’accompagne ni de rejet ni de GVH. Par contre, dans les cas d’aplasie, certaines non-prises plaident pour l’origine auto-immune de la maladie. Ainsi, actuellement, entre un frère HLA génotypiquement identique et un jumeau, le choix pourra se porter sur le frère génotypiquement identique.
  Chez l’animal comme chez l’homme, le donneur HLA génotypiquement identique est le meilleur possible, maigre la survenue de rejet et de GVH dans 50 p. 100 des cas, responsables d’une mortalité de 20 p. 100. Cela prouve qu’a côté du complexe majeur d’histocompatibilité existent d’autres systèmes mineurs d’histocompatibilité qui ont un rôle important après greffe de moelle allogénique.
• Un donneur familial HLA phénotypiquement identique peut être trouve parmi les frères et soeurs du patient, si les parents ont un haplotype commun, le plus souvent en cas de mariage consanguin. Les résultats sont équivalents a ceux des greffes apparentées génotypiquement HLA identiques.
• Vu la taille des familles en France, seuls 30 p. 100 des patients pourront trouver à l’intérieur de leur famille un donneur géno-identique et 10 p. 100 un donneur phéno-identique. Pour les 60 p. 100 restants, des 1986 s’est crée en France un registre de donneurs volontaires pour trouver un donneur HLA phénotypiquement identique non apparenté, registre connecté en 1992 a un fichier européen.
• Des greffes avec donneur apparenté non HLA identique ont été réalisées à partir de donneurs intrafamiliaux avec un haplotype HLA identique alors qu’existait une incompatibilité sur un, deux ou trois antigènes (A, B, DR) sur l’autre haplotype. Dans les déficits immunitaires sévères de l’enfant, l’augmentation du conditionnement, la déplétion de la moelle en cellules T et l’utilisation d’anticorps monoclonal contre la molécule d’adhésion LFA-I donnent des résultats satisfaisants. Ces résultats ne sont pas observés dans les autres indications, l’incidence du rejet et de la GVH augmentant avec le nombre d’incompatibilités.

Perspectives

Les progrès rapides de nos connaissances sur le système HLA et son rôle en transplantation autorisent a prédire, en ce qui concerne les typages HLA, la disparition progressive de la sérologie en raison de sa complexité, de sa fiabilité et de sa reproductibilité relatives et de son coût au profit de la biologie moléculaire fiable, reproductible, automatisable. La sérologie à l’aide d’anticorps monoclonaux, dont les réactifs sont spécifiques et standardisés, conservera une place dans les typages d’urgence. Le rôle des différents allèles et loci sera précisé afin d’établir la hiérarchie des incompatibilités et de permettre un meilleur choix du couple donneur-receveur en augmentant le nombre de greffes compatibles. Outre les classiques antigènes HLA A,B,C et DR DQ DP, le système HLA comporte de nombreux autres gènes (TAP, LMP, TNF...) impliqués dans le contrôle des réponses immunes, dont les poids respectifs dans la stimulation allogénique constitueront un véritable index immunogénétique. La connaissance de la structure et des interactions moléculaires entre les molécules HLA et leurs partenaires (TCR, peptides, superantigènes) permettra le développement de nouvelles méthodes immunosuppressives spécifiques (analogues de peptides bloquant la réponse immune) ou même d’inducteurs de tolérance (anticorps monoclonaux).